با توجه به اخذ گواهینامه ایزو 14001 در موضوع حمایت از محیط زیست، تا اطلاع ثانویه فروش کتب به صورت نسخه چاپی در انتشارات زیست فناوری ایران ممنوع خواهد بود.

پیشگفتار کتاب طراحی پرایمر

امروزه انتخاب و یا طراحی پرایمر (آغازگر) به عنوان یکی از تکنیک های مهم در حوزه علوم زیست فناوری و ژنتیک نقشی مهم و کاربردی در ابعاد پژوهشی و صنعتی دارد. اصول انتخاب صحیح یک پرایمر و یا طراحی آن همواره نیازمند استفاده از متدها و تکنیک های فراوانی است که تلاش شده است در این کتاب برای اولین بار گنجانده شود.
با توجه به گستردگی کاربرد پرایمرها در تکنیک های مختلف PCR و هماهنند سازی و همچنین لزوم توجه به اختصاصیت و همچنین ارزیابی دقیق در نواحی ژنی هدف، لازم است به نگات بیشتری در انتخاب و یا طراحی پریمر پرداخته شود.
کتاب طراحی پرایمر (مقدماتی تا پیشرفته) نیاز دو دسته از پژوهشگران را برطرف می کند، دسته اول افرادی که آشنایی با تفاوت های انتخاب پرایمر و طراحی پرایمر را ندارند و گروه دوم، پژوهشگران و صنعت گرانی که در انجام یک پژوهش و یا تولید یک محصول حاوی پرایمر، نیاز به استفاده از تکنیک های تخصصی برای طراحی توالی های اولیگونوکلئوتیدی با حساسیت بیشتر را دارند.
این کتاب با همت پژوهشگران و محققین شرکت دانش بنیان نسیم تشخیص آزما (NTA) به تالیف درآمده و همواره تلاش شده است، اصول اختصاصی طراحی پرایمر در تکثیر قطعه مورد نظر با کارایی بالا که قابل استفاده در صنعت تشخیص مولکولی، سنتزهای ژنتیکی و فراورده های حاصله از تکثیر ژنوم، و... است ارائه و آموزش داده شود. علاوه بر آن، در این کتاب سعی بر آن شده است تا مفاهیم به صورت روان بیان و تمامی نکات لازم، برای طراحی یک پرایمرکارآمد، از ابتدایی ترین نکات، تا نکات مهم و پیچیده آموزش داده شود.

مجید مسگرطهرانی - مشاور اجرایی و عضو هسته مرکزی قطب علمی ژنومیک کشور

سرفصل های کتاب طراحی پرایمر

فهرست
مقدمه
معرفی پرایمر در سیستم همانندسازی
معرفی پرایمر سنتزی
تکنیک واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)
معرفی تکنیک PCR
کاربردهای تکنیک PCR
اجزای واکنش PCR جهت راه اندازی واکنش
اسیدهای نوکلئیک الگو
جمع آوری نمونه ها و پایدار کردن آنها
استخراج اسیدهای نوکلئیک و خالص سازی آنها
ذخیره سازی اسیدهای نوکلئیک
آنزیم Polymerase
پرایمر
غلظت پرایمر
بهینه سازی غلظت پرایمر
دئوکسی نوکلئوتید تری فسفات (dNTP)
بافر
یون های موجود در مخلوط واکنش PCR
میزان اجزای یک واکنش PCR
کاربردهای پرایمر
پرایمر جهت اهداف تشخیصی
شناسایی جهش ها
توالی شناخته شده
توالی ناشناخته
شناسایی حذف ها
تکنیک Multiplex PCR
بررسی تنوع ژنتیکی در ژنوم انسان
انواع تنوع ژنتیکی
SNP
Minisatellite
Variable number tandem repeats (VNTR)
Microsatellite
Short tandem repeats (STR)
تکنیک های گسترش یافته بر پایه تنوع ژنتیکی
RFLPPCR
ARMSPCR
TETRA ARMSPCR
پرایمر جهت اهداف مربوط به تکثیر RNA
تکثیر RNAهای کدکننده پروتئین
Reverse transcriptase PCR (RTPCR)
سنتز cDNA
آنزیم Reverse Transcriptase
پرایمر سنتز cDNA
Random Hexamer Primer
Oligo dt Primer
Gene Specific Primer
انواع RTPCR
One step RTPCR
Two step RTPCR
تکنیک Real time PCR
کاربردهای تکنیک Real time PCR
معرفی تکنیک Real time PCR
راه اندازی واکنش Real time PCR به همراه کنترل های واکنش
استخراج RNA و تعیین کمیت و کیفیت آن
تایید نهایی محصولات
آنالیز داده ها
انواع Real time PCR
DNA binding agent
آنالیز منحنی ذوب (Melting curve analysis)
SYBR Green
الیگونوکلئوتیدهای لیبل شده با فلورفور (Fluorophorelabeled oligonucleotide)
پروب های هیدرولیزی
TaqMan Probes
پروب های هیبرید
Molecular beacons
تکثیر RNAهای غیر کدکننده
تکنولوژی Antisense
تداخل RNA (RNA interference)
SiRNA
طراحی siRNA
miRNA
تاریخچه شناسایی microRNA
بیوژنز microRNA
مکانیسم عمل microRNA
نقش microRNAها در سرطان
کاربرد microRNAs به عنوان بیومارکر
پرایمر miRNA
روش مبتنی بر پرایمرهای Stem loop
روش مبتنی بر پلی آدنیلاسیون
پرایمر جهت اهداف مربوط به کلونینگ
مراحل کلونینگ
ایجاد مولکول DNA نوترکیب
تهیه نمونه های DNA هدف (Insert)
وکتورها
وکتورهای مناسب برای E.coli
ویژگی های پلازمید pBR
ویژگی های باکتریوفاژ M
وکتورهایی برای یوکاریوت ها
ویژگی های پلازمید میکرونی
Digestion and Ligation
انتقال DNA نوترکیب به درون سلول های میزبان (Transformation)
شناسایی سلول های حاوی مولکول DNA نوترکیب
تکنیک های مستقیم
تکنیک های غیر مستقیم
طراحی پرایمر و پروب
شاخصه های طراحی پرایمر
طول پرایمر (Primer Length)
دمای ذوب Tm (Melting Temperature)
دمای اتصال Ta (Annealing Temperature)
بهینه سازی دمای Ta پرایمر
محتوای GC (GC Content)
ساختارهای ثانویه (Secondary Conformation) و مناطق مکمل داخلی (Internal Complementary region)
انواع ساختارهای ثانویه
ساختارهای سنجاق سری (Hairpins) یا ساقه - حلقه (stem loop)
ساختار پرایمر - دایمر (Primer Dimer)
انواع پرایمر - دایمر
SelfDimer یا Homo Dimer
Cross Dimer یا Hetro Dimer
ساختارهای ثانویه در الگو (Template Secondary Structures)
ساختارهای Runs و Repeats
تکرارهای مستقیم (Direct repeats)
تکرارهای معکوس (Inverse repeats)
Homopolymeric Runs
گیره GC (GC Clamp)
طول محصول PCR (Amplicon/PCR Product Length)
پایداری اتصال انتهای` (`end Stability)
انتخاب جایگاه محصول (Product position)
سایر نکات طراحی پرایمر
طراحی پرایمر Degenerate
طراحی پروب
مراحل طراحی پرایمر
به دست آوردن توالی ژن هدف
به دست آوردن توالی یک ژن یوکاریوتی
به دست آوردن توالی یک ژن پروکاریوتی
طراحی پرایمر با در نظر گرفتن شاخصه های طراحی به کمک نرم افزار
BLAST کردن توالی پرایمر طراحی شده و اطمینان از اختصاصی بودن آن
سنتز شیمیایی الیگونوکلئوتیدها
مراحل سنتز الیگونوکلئوتیدها
کنترل کیفی الیگونوکلئوتیدهای سنتز شده
آنالیز HPLC جهت تعیین خلوص الیگونوکلئوتید
تست تایید خلوص محلول با GC
سفارش پرایمر و پروب
آماده سازی پرایمر و پروب جهت انجام واکنش PCR
رقیق سازی پرایمر
محاسبات
روش انجام
تهیه استوک storage μM
تهیه استوک working μM
رقیق سازی پروب
TE buffer (TrisEDTA buffer)
تهیه بافر X TE
تهیه .M EDTA
تهیه M Tris
پایداری الیگونوکلئوتیدها
منابع

معرفی پرایمر در سیستم همانندسازی

همانندسازی ژنوم فرایندی است که طی آن ماده وراثتی دو برابر می شود. به طور کلی برای همانندسازی سه سوبسترا اصلی باید وجود داشته باشد، نوکلئوتیدهای تری فسفاته، الگوی تک رشته ای و پرایمر. بعد از فراهم شدن سوبسترای لازم برای همانندسازی، حال به آنزیمی برای پلیمریزاسیون DNA نیاز داریم. این وظیفه بر عهده DNAپلیمراز (DNA pol) است. آنزیم های DNA pol آنزیم هایی هستند که نوکلئوتیدهای تری فسفاته را به نوکیئوتیدهای مونوفسفاته تبدیل نموده و بر اساس مکمل بودن بازها، آن ها را در مقابل رشته الگو قرار داده و سپس نوکلئوتید جدید را از طریق یک پیوند فسفودی استر به آخرین نوکلئوتید موجود در رشته در حال سنتز اضافه می نماید. آنزیم های DNA pol وابسته به الگو، نمی توانند سنتز DNA را روی مولکولی که کاملا تک رشته ای است شروع کنند لذا به یک انتهای 3`OH آزاد برای شروع پلیمریزاسیون نیازمندند. نوکلئوتید جدید از انتهای 5`P خود به 3`OH متصل می گردد، با توجه به این موضوع همواره پلیمریزاسیون در جهت 5` به 3` انجام می پذیرد. یک سری واکنش های آغازکننده، این سر 3`OH یا سر نخ دیگری را در اختیار آنزیم DNA pol قرار می دهند.

معرفی تکنیک PCR

وجه تسمیه نام گذاری به عنوان واکنش زنجیره ای پلیمراز (Polymerase Chain Reaction) این است که آنزیم پلیمراز را به تعداد حدودا 40 بار (بسته به تعداد سیکل) و به صورت متوالی مجبور به فعالیت می کنیم.PCR در واقع شبیه سازی همانندسازی طبیعی DNA می باشد به این صورت که PCR با استفاده از اجزای همانندسازی طبیعی DNA، اما داخل لوله آزمایش DNA را تکثیر می نماید. در یک سلول زنده همانندسازی ژنوم در یک فرایند بسیار پیچیده با دخالت چند آنزیم مختلف از جمله توپوایزومراز و هلیکاز و ... صورت می گیرد در صورتی که در PCR تنها به وسیله آنزیم پلیمراز و گرم کردن و سرد کردن های متوالی توسط دستگاه ترموسایکلر انجام می گیرد. DNA به حرارت مقاوم است و تنها اتفاقی که در مواجهه با حرارت برایش می افتد دناتوراسیون است که آن هم با رناتوراسیون به حالت اولیه باز می گردد.
در ساده ترین تعریف برای مراحل همانندسازی، DNA دو رشته ای از هم باز می شود و هر رشته از مولکول اولیه به عنوان الگوی ساخت یک رشته مکمل جدید استفاده می شود. این مرحله تکثیر بر توانایی نوکلئوتیدها برای جفت شدن با باز مقابل خود بر اساس قوانین واتسون - کریک استوار است، همیشه A با T و C با G جفت می شود، بنابراین رشته الگو توالی بازی رشته مقابل را تعیین می کند.

کاربرد تکنیک PCR

پیش از معرفی تکنیک PCR توسط Kary Mullis در سال 1983، تکثیر DNA از طریق کلون سازی امکان پذیر بود. در کلون کردن ژن ها، یک قطعه DNA با استفاده از لیگاز به یک حامل کلون سازی متصل و با آن درون یک سلول میزبان از قبیل باکتری E.Coli وارد می شود. هم زمان با رشد باکتری، مولکول DNA نوترکیب از طریق سیستم همانندسازی آن تکثیر می شود. پس از اینکه تعداد سلول ها به اندازه کافی رسید می توان DNA نوترکیب را تخلیص کرد. اما این پروسه چندین روز به طول می انجامد در مقابل PCR که در عرض چند ساعت و Real Time PCR که در حدود یک ساعت زمان می برد. بنابراین در موارد متعددی تکثیر از طریق PCR جایگزین کلون سازی شده است اما نه در همه موارد به عنوان مثال در PCR حتما باید توالی نوکلئوتیدی قطعه مورد نظر را بدانیم پس نمی تواند برای بررسی ژن های جدید به کار رود. هم چنین، PCR در اندازه طول قطعه ای که توانایی تکثیر آن را دارد نیز محدودیت دارد، حتی با پروتکل های بهینه شده ای مانند Long-Range PCR حداکثر طول قطعه تولیدی بیشتر از 40 Kbp نخواهد بود. در کلون سازی نیز در برخی وکتورهای اولیه همچون پلازمیدها و باکتریوفاژها، محدودیت هایی از منظر طول قطعه DNAای که می تواند درون آنها قرار داده شود وجود داشت. در وکتورهای نسل بعد که کازمیدها بودند می توانستند قطعاتی در حدود 50 Kbp را درون خود جای دهند. توسعه (Bacterial Artificial Chromosome) BACs و Yeast artificial chromosomes (YACs) کلون سازی قطعات DNA با اندازه 300 Kbp تا 1000 Kbp را امکان پذیر ساخت.

PCRنگرش ما را نسبت به تحقیقات در زمینه های علوم پایه و پزشکی، آزمایشات جنایی و تحقیقات زیست محیطی متحول کرده است. از جمله این تحولات می توان به موارد کاربرد در آزمایشگاه های بالینی جهت شناسایی بیماری های عفونی به طور سریع قبل از اینکه شواهدی همچون پاسخ آنتی بادی مشاهده شود، حساس و بدون نیاز به کشت و همچنین آزمایشگاه های تشخیص ژنتیک که در آنها سرعت و دقت عوامل تعیین کننده هستند، اشاره کرد.

تهیه نسخه های متعدد از یک ژن به منظور بررسی حضور و یا عدم حضور یک ژن، تشخیص بیماری ها قبل از تولد، تعیین جنسیت جنین، تشخیص بیماری های ژنتیکی، عفونی و سرطان، پیش بینی استعداد ابتلا به بیماری، مطالعه مقادیر اندک DNA، تکثیر RNA، مقایسه ژنوم های مختلف، تعیین ابوت و ... از جمله دیگر کاربردهای این تکنیک هستند.